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各位科研小伙伴们，大家应该越来越清晰地感受到纯生信文章内卷越来越严重了吧。两三年前，纯生信文章随便下载个GEO/TCGA数据，简单做一下差异分析、GO分析、KEGG分析、PPI分析、生存分析就可以发表了，然而这样的日子很短，随着越来越多人加入到生信数据挖掘的大军中，这样的纯生信文章一天比一天多，内卷一天比一天严重，扎堆投稿日益严重，常规分析套路越来越难发表。那么这就需要我们对分析方向、思路和方法进行创新，一般是结合研究热点构建模型，比如免疫评分、自噬相关基因、m6A基因、缺氧基因、铁死亡相关基因，但是这种热点也有一定的红利期，大概1到2年时间就出现疲态了（PS：目前铜死亡就处于热点刚开始的红利期，想做这个方向纯生信的小伙伴尽早入手哦

）。除了追逐新热点（毕竟新热点红利期比较短，比较注重时效性也容易思路撞车），要想发高分文章就需要在之前热点上对分析思路和方法进行创新，比如今天要分享的这篇文章进行的铁死亡泛癌分析，在“铁死亡”纯生信常规思路普遍2-3分的水平下，靠“泛癌分析+分析方法另辟蹊径”才能抢占到5分文章的一席之地，下面我们就一起来看看文章具体怎么做的吧

数据库应用

• KEGG数据库：从KEGG铁死亡通路图谱中鉴定了41个基因；
• FerrDb 数据库：确定铁死亡调节基因的属性；
• TCGA数据库：下载了 33 种癌症的基因表达信息和相关临床数据；
• GEO数据库：下载了包含正常对照和实验样本的微阵列数据集GSE104462和GSE147625；
• cBioPortal 数据库：下载了免疫治疗队列数据（SKCM_DFCI_2015 队列），获得泛癌样本的 MSI 状态和肿瘤突变负荷；
• Cistrome Cancer 数据库 ：获得318 个肿瘤相关转录因子 (TF)；
• CellMiner 数据库：获得36 个预测的铁死亡药物靶点及其 RNA 复合表达的数据；
• SwissTargetPrediction数据库和CTD数据库：分析环磷酰胺的靶基因；

分析思路与流程

文章研究思路和分析流程如下图。作者利用KEGG、FerrDb 数据库、PubMed 和 Google Scholar 鉴定铁死亡调节因子，在泛癌水平对铁死亡调节因子进行转录水平和预后分析。然后，针对铁死亡调节因子鉴定和验证了其转录因子和靶向药物。最后评估了铁死亡调节因子与癌症免疫原性特征的关联，建立了铁死亡评分并评估了其在癌症中的临床意义。

主要结果

1、在33 种癌症类型中鉴定铁死亡调节因子的转录水平变化和预后作用

2、鉴定和验证癌症中铁死亡调节因子的转录因子和靶向治疗药物

3、在erastin治疗和GPX4敲低队列以及癌症相关通路中探索铁死亡的分子机制

4、铁死亡调节因子与癌症免疫原性特征的相关性

5、确定铁死亡评分的预后价值

6、免疫治疗队列中高/低铁死亡评分组间免疫治疗反应和免疫原性特征的比较

1. 在33 种癌症类型中鉴定铁死亡调节因子的转录水平变化和预后作用

基于KEGG、FerrDb 数据库、PubMed 和 Google Scholar的筛选和鉴定，共获得30个铁死亡调节基因，并将其分为铁死亡驱动基因和铁死亡抑制基因（图1A）。在33个癌种类型数据集中分析铁死亡相关基因表达，发现GPX4、SLC7A11和GSS在一些癌症中高表达，而ACSL1和ACSL4在一些癌症中低表达，尤其是GPX4在13种癌症中显著高表达（图1B, C）。此外，在 33 种癌症类型中分析了调节因子与患者生存率的相关性，发现TFRC是ACC、BLCA等9种癌症的危险因子，GPX4是BRCA等4种癌症的保护因子。为阐明铁死亡调节因子的转录组特征进行PPI网络构建，结果表明SLC7A11和GCLC的表达水平有很强的相关性（图1D, E）。以上结果表明，铁死亡基因在不同癌症中表达水平，表达模型和预后不同，铁死亡基因在不同癌症中发挥重要作用。

2. 鉴定和验证癌症中铁死亡调节因子的转录因子和靶向治疗药物

作者利用Cistrome数据库预测铁死亡调控因子的转录因子，桑基图显示，铁死亡调控因子与上游调控因子显著相关（图1F）。接下来作者探讨了与铁死亡调节因子RNA 复合表达相关的治疗药物活性的平均z-score，并预测了 36 种潜在的铁死亡药物（包括环磷酰胺）以及铁死亡相关基因表达水平的相关性（图2）。随后分析了环磷酰胺的三维分子结构以及环磷酰胺和 GPX4 蛋白的分子对接位点（图3A, B），利用Swiss Target Prediction和CTD数据库筛选环磷酰胺的靶点（图3C），并对两个数据库中共有的靶点进行GO和KEGG富集分析（图3D, E）。以上结果表明，这些上游转录因子和铁死亡调节因子的靶向治疗药物，尤其是环磷酰胺，因其靶向GPX4而被视为铁死亡诱导剂。

3. 在erastin治疗和GPX4敲低队列以及癌症相关通路中探索铁死亡的分子机制

为了研究铁死亡调节因子之间的串扰关系，作者鉴定GSE104462数据集中erastin处理后肝癌细胞中的差异表达基因（图4A）。对其中差异表达的铁死亡基因进行GO和KEGG通路富集分析，发现通路（IL-1介导的信号传导）和生物学过程（对IL- 12，DNA复制和细胞凋亡）在erastin治疗组中高度富集（图4B，C）。

为了进一步探索铁死亡的分子机制，作者还使用GSE147625队列（野生型和 GPX4 敲低滋养层）识别DEGs。富集分析表明血管生成和蛋白激酶调控活性等功能显著富集（图5B，C）。GSVA分析表明，G2/M检查点和TNF-α介导NF-kB信号通路具有高度差异通路打分，表明其与铁死亡相关过程呈正相关。为了进一步了解铁死亡调控因子对癌症的影响，作者研究铁死亡调控因子和50条癌症核心通路的关系（图6A）。TP53、FTL和SLC40A1与炎症反应和IL2/STAT5信号通路正相关。ALOX15、TP53和SLC40A1与MYC靶点和DNA修复通路负相关。

4. 铁死亡调节因子与癌症免疫原性特征的相关性

为了评估铁死亡调节因子与癌症间质和免疫评分之间的关系，作者利用ESTIMATE算法计算了33种癌症类型的基质打分、免疫打分、ESTIMATE打分和肿瘤纯度，并计算打分与30个铁死亡调控因子表达水平的相关性，发现HMOX1、FTL、SAT1 和 ATG7 基因的表达水平与上述打分指标高度相关（图6B）。然后，作者通过 CIBERSORT 确定了铁死亡调节因子表达水平与免疫细胞浸润水平之间的关系（图6C，E），发现GPX4与与巨噬细胞（M1和M2）、活化的肥大细胞和静息记忆 CD4+ T 细胞呈显着正相关，与 M0 巨噬细胞、静息肥大细胞、滤泡 T 细胞和Tregs呈负相关（图6C）。47种常见免疫检查点基因表达水平与铁死亡调控因子的相互作用如图6D，F所示。以上结果均证实了铁死亡调节因子在肿瘤免疫中起关键作用。

5. 确定铁死亡评分的预后价值

作者首先利用基因集变异分析 (GSVA) 计算了每个基因集的铁死亡评分。不同癌症类型的铁死亡评分与铁死亡调节因子表达的关系如图7A所示，除 TP53、GPX4 和 GSS 等个别基因外，大多数铁死亡调节因子与不同癌症类型的铁死亡评分呈良好的正相关关系。图7B显示了TCGA中所有样本的铁死亡评分与泛癌中铁死亡调节因子表达之间的相关性，发现肿瘤样本中铁死亡的整体状态下调（图7C）。此外，在三个数据集（GSE121689、GSE31060和GSE104462）中验证了癌症样本在铁死亡激动剂和抑制剂治疗下的铁死亡评分变化，结果表明，在两种类型的铁死亡激动剂erastin和索拉非尼治疗下，铁死亡评分上调，但使用铁死亡抑制剂ferrostatin-1后评分下调，与癌细胞铁死亡状态的激活或抑制一致（图7E）。结合上述，铁死亡评分可以有效地代表癌细胞的铁死亡状态。

接下来，作者分析了铁死亡评分在癌症中的临床意义。使用 X-tile 软件将样本分为以下两组：高铁死亡评分组和低铁死亡评分组。较高的铁死亡评分表明 KIRP、LAML、THCA、THYM、UCS 和 UVM 患者的生存率较差，但 SKCM 患者的生存率较高（图 8A）。进一步KM 曲线分析表明除 SKCM 患者外，高铁死亡评分患者的预后明显差于低铁死亡评分患者（图8C）。为了验证了癌症之间铁死亡评分的独立预后能力，作者对THCA数据集进行分析，根据临床特征将THCA分为两组（图8B）并计算ROC曲线（图8D和8E）。随后评估了MSI，TMB和免疫检查点与各种癌症类型的铁死亡评分的关联，如图8G-8I所示MSI 与 THCA 和 SKCM 细胞的铁死亡密切相关，而 TMB 与铁死亡的 UCEC 和 TGCT 细胞密切相关，免疫检查点基因表达也显示出与铁死亡评分的普遍关联。

6. 免疫治疗队列中高/低铁死亡评分组间免疫治疗反应和免疫原性特征的比较

为了进一步验证铁死亡评分在免疫治疗反应和免疫原性特征中的作用，作者选择了一个免疫治疗队列（SKCM DFCI 2015 队列）进行后续评估，结果发现在免疫治疗后，SKCM DFCI 2015 高铁死亡评分的队列患者的生存状态大大增加（图9A，B）。然后，基于年龄、性别和铁死亡评分这三个独立因素生成列线图：并且基于列线图搭建了一个在线网络服务（https://zjuresearch.shinyapps.io/dynnomapp/），可以根据患者的年龄、性别和铁死亡评分得到相应的生存图，方便临床医生预测接受免疫治疗的患者的生存概率。最后作者分析了铁死亡评分与肿瘤免疫特征之间的关系，铁死亡评分较高的组显示出较高的免疫浸润评分、HLA 表达、免疫细胞浸润和免疫检查点表达（图 9J-N和 10A-F)。此外，基因集富集分析（GSEA）表明，高铁死亡评分与免疫相关途径呈正相关，包括 5 条 GO 途径和 5 条标志性途径（图 10G-H）。这些结果表明，铁死亡评分与免疫治疗反应和肿瘤免疫微环境密切相关。

文章小结

本文中作者在 33 种癌症类型中鉴定和分析了 30 种铁死亡调节因子，综合分析了铁死亡调控因子在33种癌症类型中的转录水平差异并构建蛋白-蛋白互作网络，并且针对铁死亡调控因子预测了靶向药物活性。分析了铁死亡调控因子与癌症标志通路、免疫特征的相关性，利用 GSVA 方法确定了铁死亡评分，并且可作为癌症发病和复发的独立预后指标。最后还创建了一个基于列线图预后模型的在线网络服务器，以预测免疫治疗队列的存活率。

文章的亮点和创新点在于作者不仅在泛癌水平分析了铁死亡调节因子的表达差异、功能并构建了铁死亡评分，还针对铁死亡调控因子进行靶向药物活性的预测和筛选，内容丰富、数据量比较大，分析内容覆盖面比较广，最后构建了一个在线网络服务器提高了研究的临床意义。

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