MIT《Science》:100小时!对大脑进行单细胞级成像

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了解人体器官功能和功能障碍需要详细绘制细胞及其在器官范围内的连接的解剖和分子结构图。成像和分子表征技术的进步极大地丰富了对功能区域以及细胞及其分子特性在人体器官内的解剖组织的理解。然而，当前仍然缺乏能够以全面的方式捕捉单个细胞及其在器官范围内连接的多尺度多组学特性的技术。

来自美国麻省理工学院的Kwanghun Chung团队开发了一个可扩展的技术平台，可用于同时绘制器官范围结构和从同一组织获取的细胞的包括分子、形态学和连接性信息在内的高维特征。该平台包括：一个机械装置，能够进行保留连接性的组织切片；一种化学技术，用于工程化组织的物理化学性质，以实现多重多尺度分子成像；一个计算工具，用于单细胞项目组映射。本文将机械、化学和计算工具完全集成，以实现对人体器官规模组织的多重多尺度分子表型的详细分析。相关工作以题为“Integrated platform for multiscale molecular imaging and phenotyping of the human brain”的文章发表在2024年06月14日的国际顶级期刊《Science》。

1.创新型研究内容

随着高通量单细胞和单核RNA测序（RNA-seq）技术的发展，可以通过它们的转录组特征区分更多的细胞类型，但这些方法本质上限制了对细胞空间信息和解剖细节的获取。空间转录组学的进步使得在组织背景下系统分析细胞组成成为可能。然而，将这些方法扩展到覆盖整个人类大脑以及多个个体仍然具有挑战性。此外，单独的转录组分析无法提供理解细胞功能特性的关键信息，如细胞形态、连接性、亚细胞结构和蛋白质翻译后修饰以及追踪。因此，需要开发技术以捕获单个细胞及其全脑范围连接性的多尺度多组学特性。

为了应对这一挑战，本文开发了一个完全集成的可扩展技术平台，通过同时映射全脑结构和来自同一完整人脑的细胞的高维特征（空间、分子、形态、微环境、纳米级和连接信息），以亚细胞分辨率建立3D人脑细胞图谱。本文通过无缝集成新的机械、化学和计算工具，实现了对人类脑组织的高多重性多尺度3D蛋白质表型分析（图1）。通过处理整个人脑半球并研究阿尔茨海默症（AD）病理学，证明了其实用性和可扩展性。

图1 集成平台用于人类大脑的多尺度分子探测方案

【MEGAtome 使得超大型生物组织的高精度切片成为可能】

振动切片机是用于切割软组织的工具。然而，传统的振动切片机（如Leica VT1200）仅限于处理小样本，并且经常导致组织损伤。此外，由于它们的刀片振动速度有限且刀片在平面外的振动较大，切割表面常常遭受磨损、撕裂和变形。为了解决这些限制，本文开发了一种高度通用的振动切片机，称之为MEGAtome（机械增强的大型无磨损振动切片机），它能够对广泛的生物样本进行超精密切片，从小的类器官到完整的人脑半球以及大型动物器官阵列。MEGAtome实现了高频刀片振动，增加了振幅并降低了平面外振动位移。

分析建模和实验数据表明，有三个重要参数有利于提高振动切片机的精度和可扩展性：(i) 高刀片振动频率，(ii) 高振动幅度，以及 (iii) 最小的平面外刀片位移。为实现这些关键元素，本文设计了一种新的刀片振动产生和控制机制，基于多自由度（multi-DOF）柔性串联系统。多自由度设计的优势在于其能够在更高频率和更大振幅下操作。模拟和实验揭示了在第二共振频率（约145 Hz）时刀片振幅的增加。MEGAtome的刀片振动幅度随其振动输入线性增加，在140 Hz时达到3.4 mm的峰峰值，超过了VT1200，后者在85 Hz时的峰峰值为2.4 mm。这些结果表明MEGAtome克服了典型单自由度系统中刀片振动频率和振幅之间的权衡，实现了比VT1200高出2.33倍的刀片振动速度，且频率高出1.65倍。

图2 MEGAtome的机械设计与表征，用于可扩展、无信息损失的切片

【整体切片和大规模组织样本的成像】

机械切片对于成像大型样本（如人体器官）是十分必要的。尽量减少从大型样本中切割的组织块数量是有利的，因为这可以大大减少人工、成本和信息损失。例如，将整个人类大脑半球整体切片成完整的厚冠状切片是非常理想的，因为将同一个大脑切成立方体块会产生成千上万的额外碎片。为了安全地整体安装人脑半球以便重复切片，本文首先提出了一个方案，将大脑嵌入并在水凝胶中进行化学交联。本文证明了MEGAtome成功地切片了整体安装的人脑半球，并在8小时内生成了40个连续的4毫米厚的切片。

为了成像大型切片，本文开发了一台多色倒置轴向扫描光片荧光显微镜，称之为MegaSPIM。MegaSPIM能够使用2×到25×的物镜捕捉多尺度数据，提供近各向同性分辨率和体素尺寸。MegaSPIM配备了连续波长的多色激光源，工作在405、488、561、647和785纳米。定制设计的载物台可以容纳组织尺寸达180毫米乘以380毫米，使得以单细胞分辨率成像扩展的冠状人脑半球切片成为可能。使用MegaSPIM，本文展示了整个人类大脑半球的高吞吐量细胞分辨率成像。图3D显示了一个SHIELD清除的4毫米厚冠状人脑切片和子区域的注释。经过抗NeuN（神经元核蛋白）抗体染色后，在6小时内完成了整个切片的成像，捕捉到了NeuN+神经元的三维分布。使用一台MegaSPIM，可以在大约100小时内以单细胞分辨率成像整个大脑半球。

图3 大规模切片和高通量成像整个人类大脑半球及一系列动物器官规模的组织

【mELAST 使得对大规模组织进行多重多尺度成像成为可能】

组织转化成可渗透大分子且光学透明的水凝胶是研究复杂三维生物系统的有效方法。CLARITY技术通过将组织与合成聚合物水凝胶混合，促进了完整组织的全面成像。组织扩展策略通过赋予组织-水凝胶混合物超吸收性，实现了超分辨率成像。利用具有许多滑动链接的聚合物水凝胶将厚组织转化为弹性材料，可以实现快速探针传输。然而，能够实现大规模人脑多重多尺度成像的集成技术仍未被开发。

为了应对这一挑战，本文开发了一个组织处理平台，称之为mELAST（可伸缩增强链接扩增弹性组织-水凝胶），其整合了SHIELD、SWITCH、MAP和ELAST技术。SHIELD确保在反复染色、成像和去染色周期中永久保存蛋白质。经过SHIELD处理后，mELAST通过原位聚合和后续处理将组织转化为弹性、热化学稳定且可逆扩展的组织-水凝胶混合物。本文在水中实现了4.5倍的线性扩展，同时保持了组织-水凝胶的弹性、完整性和高耐用性。mELAST成功地保存了蛋白质表位，并且在周期性压缩或组织扩展期间没有丢失结构或分子信息。mELAST协议高度可扩展，普遍适用于整个冠状人脑切片和其他物种及器官，无需进一步优化。

图4 用于人类大脑的多重多尺度分子成像的mELAST组织-水凝胶处理平台

【在阿尔茨海默症中对人类脑组织的多尺度探究】
本文应用mELAST技术探究了来自两位捐赠者的人脑组织的分子和结构细节（图5和图6）：捐赠者1是一位没有患痴呆症的对照者（一位61岁的女性），而捐赠者2患有阿尔茨海默症（AD）痴呆症（一位88岁的女性）。本文使用MEGAtome对两位捐赠者的半脑进行了切片，并在相同的神经解剖学水平上获得了完整的冠状切片。

使用本文的3D细胞表型算法，NeuN+细胞在两个脑片中都被自动检测到（图5A，检测准确率为95.1%）。对整个脑片的细胞分析共得到7,464,727个NeuN+细胞在对照组，以及2,890,858个NeuN+细胞在阿尔茨海默症组。结果表明：与对照组相比，阿尔茨海默症组的NeuN+细胞密度降低了46.5%（13.0 × 103/mm3对比24.3 × 103/mm3），这一损失比之前的报告（22%至40%）更为严重。在对照组中，未观察到NeuN+细胞密度的区域差异，而在阿尔茨海默症组中，扣带回（CgG）和眶额回（OrG）的NeuN+细胞密度与其他大脑区域相比更低。

图5 人脑的单细胞分辨率成像和表型分析

为了进一步研究亚细胞结构，本文对第三层进行了高分辨率成像，结果显示在两个病例中Aβ斑块都有大量积累。在阿尔茨海默症中，大多数Aβ斑块是与神经元和突触丢失密切相关的神经性、密集核心斑块，而对照组中的Aβ斑块则是弥漫性的。正如之前观察到的，大多数Iba1+小胶质细胞处于高度分支的、有分枝的形式（77.6%），但在对照组中，围绕在弥漫性Aβ斑块内部和周围的小胶质细胞则呈现为反应性形式（22.4%）。在阿尔茨海默症中，大多数小胶质细胞（79.6%）是反应性的，这表明前额叶皮层可能在分枝/反应性小胶质细胞的比例上与其他文献分析的皮层区域相比显示出更大的差异（图6）。此外，在许多病理条件下观察到的棒状小胶质细胞在阿尔茨海默症中被识别出来（12.2%），但在对照组中未发现。所有在感兴趣区域内发现的棒状小胶质细胞的细长体轴都垂直于软脑膜表面定向。

图6 人脑的亚细胞分辨率成像和表型分析

【UNSLICE 使得多层次的人类大脑连接图谱绘制成为可能】

为实现厚组织体积的精确多尺度重建，本文开发了一个计算方案，称为UNSLICE（通过连接切割纤维端点的邻近切片组织的联合），它能够在宏观、中观（血管）和微观（轴突）层面上精确对齐解剖特征。传统的用于2D图像配准的强度或特征基配准方法（如Harris角点检测器）不适用于大型、厚型和高度处理组织的切片间配准，因为这些组织会变形，需要更相关和可靠的特征。

图7 用于大规模切片组织块的精确多级跨标本配准的UNSLICE计算路线。

【人脑轴突全脑映射及病理分析】

单独的血管系统密度不足以实现全脑映射和轴突追踪所需的单轴突分辨率配准。在达到血管分辨率配准后，其他细胞类型标记物（GFAP、PV和NFH）的纤维端点被用来优化配准结果。这种优化使得能够在单纤维尺度上进行多个切片的多通道空间重建。此外，由于UNSLICE的地形特征匹配和异常值移除步骤被设计为能够容忍纤维端点检测中的假阴性和假阳性，因此相同的血管滤波器、分割和骨架化步骤可以用于自动化的纤维端点检测，即使在端点检测F1分数在85%到90%范围内时也可以使用。

随着来自不同细胞类型标记的额外地标被纳入，通过组织切片观察到个别NFH+轴突连接的准确性逐渐提高。这种多阶段配准方法也增强了GFAP+纤维的连接性。具体来说，X 轴和 Y 轴 NFH+ 纤维连接误差的分布从凝集素配准后的 10 μm（每个横向维度）缩小到 PV/GFAP 配准后的 ~5 μm，最后在 NFH 配准后缩小到 ~1 μm。

图8 人脑中单纤维水平连接映射的多通道跨标本配准和体积轴突追踪

2.总结与展望

本文开发的技术平台使得在人类大脑规模的组织中进行可扩展且完全集成的细胞结构和分子表型分析成为可能，并且具有很高的分辨率和效率。本文预见这个平台将能够全面分析大量人类和动物的大脑，从而帮助理解物种间的同源性、群体变异性和疾病特有的特征。此外，本文的方法还使得映射单个神经元的项目组及其与分子表达谱的整合成为可能。这一独特特性将允许我们阐明神经网络的组织原理及其在人脑中的疾病特异性改变，从而推进对疾病机制的理解。

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