突破!南通大学研究发现附睾的基因表达模式和功能

附睾是一个管腔结构，由附睾头、附睾体和附睾尾组成。附睾头和附睾体的分泌蛋白在精子获得运动能力和受精能力中有重要作用；附睾尾是精子的存储场所同时维持精子受精能力。附睾三个区段共同构成了调节精子成熟的微环境。附睾微环境是由周围的假复层上皮保持的，假复层上皮由不同类型的细胞组成，包括主细胞、基细胞、透明细胞、顶细胞和晕细胞等。附睾不同的细胞表达不同类别的基因，拥有不同的基因表达模式，在精子成熟中发挥不同的生理功能。

单细胞测序是在单细胞水平对全基因组进行测序的技术。通过单细胞测序绘制出组织或器官图谱，从而明确不同基因的表达模式和状态变化。目前，运用单细胞测序技术，阐明了包括睾丸和卵巢在内的多个器官不同类型细胞的基因表达模式。然而，附睾中不同细胞的时空分布和特征基因的表达特点还不清楚。早在2020年1月6日，陈浩课题组就在预印本网站bioRxiv上发布了12,597个细胞的小鼠附睾区段单细胞测序结果。随后美国麻省医学院的课题组于1月24日在bioRxiv上刊登了他们的小鼠附睾单细胞图谱并于2020年中发表在elife中，但上述研究受限于单细胞数量不足，且附睾区段分离与领域内常用的标准也有差异。

2021年5月18日，Cell Discovery在线发表了南通大学生殖医学研究院陈浩团队的研究论文Spatio-temporal landscape of mouse epididymal cells and specific mitochondria-rich segments defined by large-scale single-cell RNA-seq文章。通过对附睾40，623个细胞进行高通量单细胞测序分析，绘制出附睾不同区段的单细胞转录组图谱，发现了新的主细胞亚群，并首次揭示了小鼠附睾是一个线粒体含量较高的组织，且线粒体数量和基因分布呈区段特异性。

陈浩教授课题组首先对42天和56天的小鼠附睾不同区段的所有细胞进行了聚类分群。UMAP图显示在去除了红细胞之后，可将所有细胞分为8个类群，包括主细胞（C0）、成纤维细胞（C1）、透明细胞（C2）、巨噬细胞（C3）、基底细胞（C4）、晕细胞（C5）、内皮细胞（C6）和精子（C7）。

附睾主细胞是附睾组织中含量最丰富的细胞类群，占到附睾上皮的80%或者附睾总细胞的50～60%左右 (Cornwall 2009)。通过较高的聚类分辨率，将附睾头部、体部和尾部的主细胞进一步分为8个亚群（Principal cell1- Principal cell8, Prc1-Prc8）。GO分析对主细胞不同亚群的差异基因进行了富集，结果显示不同主细胞亚群中的差异基因各不相同，表明不同的主细胞亚群在调节附睾微环境中发挥不同的作用。有趣的是，他们的分析结果首次富集出了长期在组织学上观察到的附睾类纤毛细胞（Stereocilia）——Prc7和Prc8细胞亚群。GO分析发现其中的基因不仅参与了鞭毛的组装过程，而且介导了微管和纤毛参与的运动过程。

出乎意料的是，小鼠附睾单细胞测序结果中线粒体基因转录百分比远超过5%，整体线粒体基因平均值达到15%。通常认为，单细胞测序结果中线粒体基因含量超过5%会被认为是细胞发生了凋亡，这类细胞在分析时会被去除 (Ilicic, Kim et al. 2016)。然而，该研究在分析中大胆的使用了较高的线粒体转录本阈值，通过不同年龄和不同的生物学重复，发现不论是第一波生精波完成的42天小鼠还是56天性成熟的小鼠，其附睾体部（20.9%）和尾部（16.3%）的线粒体转录百分比和数量均显著高于附睾头部（7.4%）。为了验证单细胞测序分析结果，接下来通过线粒体追踪荧光探针、免疫荧光组化以及Q-PCR等方法对线粒体的分布做了检测。结果表明荧光探针CMXRos、线粒体标志物细胞色素C以及线粒体基因mt-cytb, mt-ND1, mt-Co1和mt-Rnr1-2在尾部和体部的表达显著高于头部。上述的研究结果也为单细胞数据分析对线粒体含量的解读提供了新的思路。

此外，该研究也进一步分析了附睾不同细胞类群之间的相互作用以及第一生精波精子和性成熟后精子在转录组上的基因表达差异。发现附睾不同细胞类型中存在着旁分泌的配体-受体调节以及基底细胞和主细胞之间的细胞通讯和不同生精波精子之间的基因表达的显著差异，表明附睾在不同发育阶段的内环境对精子成熟的调节或许不同。

南通大学史建伍博士，香港中文大学生物医学学院Kin Lam Fok和南通大学的戴鹏远博士为共同第一作者。南通大学陈浩教授为通讯作者，南通大学解刚才教授、孙斐教授为共同通讯作者。上海交通大学第九医院的刘阳教授和周怡雯博士参与了本文的修回工作。

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41421-021-00260-7

制版人：十一

参考文献

1. Gail A, C.,Cornwall, G. A. (2009). "New insights into epididymal biology and function. ." Human Reproduction Update 15(2).

2. Ilicic, T., J. K. Kim, A. A. Kolodziejczyk, F. O. Bagger, D. J. McCarthy, J. C. Marioni and S. A. Teichmann (2016). "Classification of low quality cells from single-cell RNA-seq data." Genome Biol 17: 29.

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